类风湿关节炎的基因治疗

中华风湿病学杂志 2000年第5期第4卷 综述

作者：陈彤　杨虎天

单位：陈彤（200080 上海市第一人民医院中西医结合科）；杨虎天（200080 上海市第一人民医院中西医结合科）

　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)目前尚没有令人满意的治疗。传统的治疗药物，其作用缺乏特异性，可产生很多毒副作用。ra的现代生物治疗，能够针对特异性的靶分子，给ra治疗开拓了新的途径。但是，绝大部分生物治疗需要高度纯化的蛋白质，价格昂贵；而且蛋白质口服活性差，在体内又会很快被清除，需要反复注射；另外，它们不能选择性地到达靶组织［1］。ra基因治疗至少在理论上有可能部分克服这些缺陷［2，3］。

　　1　ra基因治疗的候选分子

　　基因治疗是指为了治疗目的，将新的遗传物质导入机体细胞的疗法［4］。ra有别于经典的遗传性疾病，不是由单基因缺陷引起，而是很可能涉及了多个尚未阐明的易感基因以及环境因素，是复杂的遗传性疾病［5］。那么基因治疗如何才有可能在ra这样复杂的遗传性疾病治疗中占有一席之地呢?回答是：基因治疗在此不是修补天生的遗传缺陷，而是给予机体细胞新的功能。

　　从理论上讲，任何能抑制ra病理的分子都是基因治疗潜在的目标［2，3］。一般认为，ra可能是遗传易感者在未知的环境因素激发下，启动了由自身反应性t细胞介导的自身免疫反应，引起一系列炎症、免疫反应和关节滑膜的增生，最终导致了滑膜炎、关节破坏以及全身累及；而细胞因子等介质介导了这些反应［5］。所以，目前ra基因治疗的靶基因主要针对这些机制，特别是细胞因子，包括：①抗炎症、免疫反应的白细胞介素-1受体拮抗剂(il-1 receptor antagonist，il-lra)和可溶性肿瘤坏死因子受体(soluble tnf receptor，stnfr)和针对il-6的反义寡核苷酸［6－11］；②调节免疫反应的il-4、il-10、il-13、vil-10(virus il-10)、tgf-β、ifn-β［12－16］；③诱导细胞凋亡或抗滑膜增生的fasl、ap-1、增生细胞核抗原(pcna)、jund、c-myc、herpes胸腺嘧啶激酶(htk)、p16［ink4a］、galectin-1［17－19］；④促进组织再生的甲状旁腺激素［20］；⑤转录因子nf-κb［21］和信号传导分子细胞质酪氨酸激酶csk［22］。其他治疗基因包括黏附因子等免疫炎症介质［23］。

　　2　基因导入系统

　　当前基因治疗所面临的最大挑战，就是如何才能有效地将治疗基因导入细胞，按需要适当地表达。除了直接应用“裸”dna等外，基因治疗的困难是缺乏理想的运载治疗基因到达靶细胞使之表达的导入系统，即载体［4］。

　　基因导入系统可分为病毒和非病毒导入系统两大类，大部分导入系统应用载体。已研究过的载体有很多，各个载体都有各自的优缺点。病毒载体又可再分为rna、dna病毒载体。rna病毒载体主要应用逆转录病毒，逆转录病毒是目前基因治疗研究中最常用的载体。病毒载体主要的潜在缺点包括：①致病可能性；②免疫原性；③大规模生产的困难性。非病毒基因导入方法包括化学技术(如磷酸钙共沉淀)、机械技术(如微注射)、脂质体、裸dna、反义寡核苷酸、核糖酶、受体介导的dna导入等。脂质体是最常用的非病毒载体。尽管目前主要采用病毒导入系统，但是非病毒导入系统正受到更多的关注。主要的优点包括安全，容易大规模生产等。目前非病毒载体最大的缺点，是不能获得较高水平的基因导入和表达。最后，还有一些杂交的基因导入系统，如病毒和非病毒相结合的导入系统。

　　基因治疗又可根据基因导入方式分为体内和体外基因治疗。体内基因治疗是指将治疗基因直接注射到体内。体外基因治疗的一般过程为：①从患者获取适当的细胞，体外培养。②将治疗基因体外导入细胞。③筛选、增生表达治疗基因的细胞。④将细胞送回患者体内。体内基因治疗过程简便，但也存在不少问题，如载体在体内被稀释或结合，不能定向于特定的靶细胞，基因导入率低等；相对照，体外基因治疗能克服上述问题，且较为安全，但操作繁琐。

　　基因治疗还可根据导入途径分为局部或全身基因治疗。前者是将治疗基因直接导入病变部位，如受累关节；后者是将基因导入适当细胞(如肝细胞)，使表达产物能进入血液循环。采用局部还是全身基因治疗一定程度上取决于疾病，如系统性红斑狼疮累及很多脏器，就很可能需要全身基因治疗。但是，这并不绝对。此外，还有很多因素影响其选择，如选用的载体［2－4］。

表1　ra动物模型中的基因治疗

方法途径载体导入基因动物模型转导细胞/注射方式体外局部逆转录病毒il-1raaia、cia、scw、zia滑膜纤维细胞、3t3细胞　全身逆转录病毒stnfr、tgf-β、ifn-βcia⒃嘞赴?⒊上宋?赴?　∈粒il-4、il-13、gal-1ciacho细胞、成纤维细胞体内局部腺病毒vil-10cia、aia、兔关节炎关节内　　　faslcia关节内　　　sil-1r、stnfraia关节内　　　p16ink4aaa关节内　　　cskaa关节内　　　胸腺嘧啶激酶恒河猴cia关节内　　腺病毒相关病毒β-半乳糖苷酶兔关节炎关节内　　仙台病毒-脂质体svt大鼠关节内　　?侍迨侗餹f-κb寡核苷酸scw关节内　　柿?l-10cia关节内、皮下　　核糖酶基质溶解酶兔关节炎关节内　　(反义)寡核苷酸nf-κb、ap-1、pcna、cia关节内　全身腺病毒vil-10cia静隆　∈粒tgf-βscw肌肉　　注：adjvant arthritis，佐剂关节炎

　　3　基因治疗在ra动物模型中的进展

　　ra主要累及关节，但一般累及多个关节，且可有全身表现，所以局部或全身基因治疗均已应用，见表1［2，3］。目前还不清楚哪一途径较好。

　　3.1　局部基因治疗：大部分ra动物实验采用了局部基因治疗。基因导入方式既有体内的，又有体外的。已研究的载体包括：①mulv逆转录病毒：在所有ra动物基因治疗中，小鼠白血病病毒(murine leukemia virus，mulv)是最常用的载体。由于逆转录病毒载体只转导分裂细胞，而大部分ra滑膜内细胞分裂并不活跃，所以主要采用体外基因治疗。应用兔膝关节作为模型，mulv载体可使导入的il-lra基因表达6周［6］。在兔抗原诱导关节炎(antigen-induced arthritis，aia)、大鼠链球菌细胞壁诱导关节炎(streptococcalcell wall-induced arthritis，scw)、小鼠酵母聚糖诱导关节炎(zymosan-induced arthritis，zia)和小鼠胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis，cia)模型中，由mulv载体将il-1ra cdna导入关节滑膜，有抗关节炎效应［8-10，24］。最近发展的高滴度载体，有望能直接注入关节进行体内基因治疗［25］。②慢病毒和腺病毒相关病毒(adeno-associated virus，aav)是另两个能整合到人染色体上的病毒。在动物实验，这两个病毒载体分别能够将治疗基因导入关节滑膜表达［24］。③腺病毒和单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，hsv)载体都已被ra动物基因治疗采用，而且可以获得高水平的基因表达。但是，第一代的腺病毒载体会引起炎症，而hsv载体则有细胞毒性［26］。腺病毒载体主要用在体内基因治疗。在aia和cia中，分别将vil-10、sil-1rⅰ、stnfrⅱ基因由腺病毒载体导入受累关节，抗关节炎效应分别是强、中、弱，而同时导入sil-1rⅰ和stnfrⅱ基因，则有协同抗关节炎作用［10-27］。值得注意的发现是，治疗基因导入一个受累关节，抗关节炎效应能在另一个未导入基因的受累关节出现［28］。④脂质体：注射载有治疗基因的阳离子脂质体于兔膝关节，基因转导率很低，表达也短暂。但最近报道，应用中性的脂质体与仙台病毒结合的载体，可以使导入基因在关节滑膜较持续的表达。在scw中，将载有识别nf-κb寡核苷酸的脂质体注射到大鼠体内，有明显的抗关节炎效应［21］。⑤裸dna：已有报道，关节滑膜细胞能摄取和暂时表达裸dna。直接关节内注射编码il-10的质粒dna，能明显改善cia。

　　3.2　全身基因治疗：在ra动物研究中，体内和体外的全身基因治疗都已尝试。在体内全身基因治疗研究中，腺病毒载体是最常用的导入系统。静脉注射载有stnfri或vil-10基因的腺病毒载体，可改善小鼠cia，但出现肝脏毒性［29］。相对照，肌注质粒dna可能较为安全。已有报道，直接导入tgf-β cdna可改善scw［30］。

　　体外全身基因治疗选择适当的转导细胞非常关键，ra动物模型中已被研究的转导细胞包括造血干细胞、脾细胞等细胞系［2，3］。应用运载il-1a和stnfri的逆转录病毒为载体，体外转导小鼠造血干细胞，然后将转导后的细胞输入小鼠体内，发现转入的基因il-1a和stnfrⅰ可以较长时间、高水平地表达。初步研究结果显示，这些导入基因的小鼠，对内毒素有增强的抵抗力，但仍易感zia和aia。淋巴细胞也是吸引人的靶细胞，但应用目前的载体，转导有困难。

　　4　ra基因治疗的临床试验

　　1996年7月，ra第1例基因治疗临床试验在美国匹兹堡医学中心开始［31］。接受治疗的患者是一名68岁的绝经后妇女，患有严重的慢性、多发性关节炎，多个关节需要接受关节成型术。这是人类通过的第一个基因治疗方案，用来治疗一种通常不认为是致命的疾病。因此临床试验主要设计为检验基因治疗在ra患者的可行性、安全性和便利性。治疗过程包括：①病人首先接受第一掌指关节手术，分离、获取自体滑膜细胞。②体外培养滑膜细胞。一半细胞通过逆转录病毒载体转导人il-1ra cdna，另一半未转导的细胞为对照。③经过极其严格的安全和质量筛选，相同数量转导和未转导的细胞，分别随机双盲地注射到患者同手的2～5四个受累掌指关节。④1周后，手术置换这4个关节。分离关节滑膜，进行基因治疗的分析。目前，世界上至少有2个应用类似方案的ra基因治疗一期临床试验正在进行中。未发表的初步结果显示，将治疗基因在ra关节导入、表达，是安全的和可能的［2，3］。

　　5　展望和问题

　　在短短的几年内，ra基因治疗已从动物实验进入了临床试验。2003年，人类基因组计划预计完成，这很可能为ra今后的基因治疗开创新的前景。最近，在分离和体外培养人体干细胞上取得的重要进展，也可能为ra基因治疗提供新的途径。基因治疗也为ra发病机制的研究提供了新的手段。

　　目前基因治疗存在的最大技术难题就是缺乏理想的导入系统，不能使治疗基因按需要表达。迄今为止，世界范围内300多个临床研究中，3 000多个病人已接受了基因治疗，值得注意的是，没有1例明确显示了临床改善［4］。最近第1例基因治疗导致患者死亡的报道，强烈提示基因治疗的安全性问题不容忽视［32］。此外，基因治疗的费用、便利、伦理道德等问题亦需解决。和其他正在发展中的ra生物治疗相比较，基因治疗在理论和实践上的优势并不显著［1-3］。基因治疗在ra动物模型中已取得了令人鼓舞的结果，但是处于幼儿期的基因治疗能否真正成为ra治疗的有效武器之一，还有待时间的证明。

参 考 文 献

　　1，moreland lw，heck lw jr，koopman wj.biologic agents for targeting rheumatoid arthritis:concepts and progress.arthritis rheum，1997，40:397-409.

　　2，evans ch，ghivizzani sc，kang r，et al.gene therapy for rheumatic diseases.arthritis rheum，1999，42:1-16.

　　3，evans ch，robbins pd.gene therapy of arthritis.intern med，1999，38:233-239.

　　4，anderson wf.human gene therapy.nature，1998，392:25-30.

　　5，feldmann m，brennan fm，maini rn.rheumatoid arthritis.cell，1996，85:307-310.

　　6，bandara g，mueller gm，galea-lauri j，et al.intraarticular expression of biologically active interleukin-1 receptor antagonist protein by ex vivo gene transfer.proc natl acad sci usa，1993，90:10764-10768.

　　7，roessler bj，allen ed，wilson jm，et al.adenoviral-mediated gene transfer to rabbit synovium in vivo.j clin invest，1993，92:1085-1092.

　　8，bakker ac，joosten lab，arntz oj，et al.prevention of murine collagen-induced arthritis in the knee and ipsilateral paw by local expression of human interleukin-1 receptor antagonist protein in the knee.arthritis rheum，1997，40:893-900.

　　9，pan ry，chen sl，xiao x，et al.therapy and prevention of arthritis by recombinant adeno-associated virus vector with delivery of interleukin-1 receptor antagonist，arthritis rheum，2000，43:289-297.

　　10，ghivizzani sc，lechman er，kang r，et al.direct adenoviral-mediated gene transfer of il-1 and tnf-α soluble receptors to rabbit knees with experimental arthritis has local and distal antiarthritic effects.proc natl acad sci usa，1998，95:4613-4618.

　　11，nletfeld jj，duits aj，tillanus mgj，et al.antisense oligonucleotides，a novel tool for the control of cytokine effects on human cartilage:focus on interleukin 1 and 6 and proteoglycan synthesis.arthritis rheum，1994，37:1357-1362.

　　12，bessis n，chiocchia g，kollias g，et al.modulation of proinflammatory cytokine production in tumour necrosis factor-alpha (tnf-alpa)-transgenic mice by treatment with cells engineered to secrete il-4，il-10 or il-13.clin exp immunol，1998，111:391-396.

　　13，kim kn，watanabe s，ma th，et al.viral il-10 and soluble tnf receptor act synergistically to inhibit collagen-induced arthritis following adenovirus-mediated gene transfer.j immunol，2000，164:1576-1581.

　　14，lechman el，carlos ca，weiss k，et al.adenoviral transfer of the viral il-10 gene periarticularly to mouse paws suppresses development of collagen-induced arthritis in both injected and uninjected paws.j immunol，1999，162:3625-3632.

　　15，chernajovsky y，adams g，triantaphyllopoulos k，et al.pathogenic lymphoid cells engineered to express tgf-β1 ameliorate disease in a collagen-induced arthritis model.gene ther，1997，4:553-559.

　　16，triantaphyllopoulos ka，williams ro，tailor h，et al.amelioration of collagen-induced arthritis and suppression of interferon-gamma，interleukin-12，and tumor necrosis factor alpha production by interferon-beta gene therapy.arthritis rheum，1999，42:90-99.

　　17，zhang h，yang y，horton jl，et al.amelioration of collagen-induced arthritis by cd95 (apo-1/fas)-ligand gene transfer.j clin invest.1997，100:1951-1957.

　　18，taniguchi k，kohsaka h，inoue n，et al.induction of the p16ink4a senescence gene as a new therapeutic strategy for the treatment of rheumatoid arthritis.nat med，1999，5:760-767.

　　19，rabinoyich ga，daly g，dreja h，et al.recombinant galectin-1 and its genetic delivery suppress collagen-induced arthritis via t cell apoptosis.j exp med，1999，190:385-397.

　　20，bonadio j，smiley e，patil p，et al.localized，direct plasmid gene delivery in vivo:prolonged therapy results in reproducible tissue regeneration.nat med，1999，5:753-759.

　　21，tomita t，takeuchi e，tomita n，et al.suppressed severity of collagen-induced arthritis by in vivo transfection of nf-κb decoy oligodeoxynucleotides as a gene therapy.arthritis rheum，1999，42:2522-2542.

　　22，takayanagi h，juji t，miyazaki t，et al.suppression of arthritic bone destruction by adenovirus-mediated csk gene transfer to synoviocytes and osteoclasts.j clin invest，1999，104:137-146.

　　23，chen sj，wilson jm，vallance dk，et al.a recombinant adenoviral vector expressing a soluble form of vcam-1 inhibits vcam-1/vla-4 adhesion in transduced synoviocytes.gene ther，1995，2:469-480.

　　24，otani k，nita i，macaulay w，et al.suppression of antigen-induced arthritis in rabbits by ex vivo gene therapy.j immunol，1996，156:3558-3562.

　　25，ghivizzani sc，lechman er，tio c，et al.direct retrovirus-mediated gene transfer to the synovium of the rabbit knee:implications for arthritis gene therapy.gene ther，1997，4:977-982.

　　26，nita i，ghivizzani sc，galea-lauri，et al.direct gene delivery to synovium:an evaluation of potential vectors in vitro and in vivo.arthritis rheum，1996，39:820-828.

　　27，ghivizzani sc，lechman er，kang r，et al，direct adenoviral-mediated gene transfer of il-1 and tnf -α soluble receptors to rabbit knees with experimental arthritis has local and distal antiarthritic effects.proc natl acad sci usa，1998，95:4613-4618.

　　28，whalen jd，lechman el，carlos ca，et al.adenoviral transfer of the viral il-10 gene periarticularly to mouse paws suppresses development of collagen-induced arthritis in both injected and uninjected paws.j immunol，1999，162:3625-3632.

　　29，apparailly f，verwaerde c，jacquet c，et al.adenovirus mediated transfer of viral il-10 gene inhibits murine collagen-induced arthritis.j immunol，1998，160:5213-5220.

　　30，song xy，gu ml，jin ww，et al.plasmid dna encoding transforming growth factor-β1 suppresses chronic disease in a streptococcal cell wall-induced arthritis model.j clin invest，1998，101:2615-2621.

　　31，evans ch，robbins pd，ghivizzani sc，et al.clinical trial to asses the safety，feasibility， and efficacy of transferring a potentially anti-arthritic cytokine gene to human joints with rheumatoid arthritis.human gene ther，1996，7:1261-1280.

　　32，lehrman s.virus treament questioned after gene therapy death.nature，1999，401:517-518.

(收稿日期：1999-09-06)